最新人工生物粒子及其制造方法

这里介绍的最新人工生物粒子及其制造方法,介绍下面内容: 人工生物粒子及其制造方法[0001] 本发明涉及使用了能够作为应用于药物释放系统(DDS)等的微囊而使用的穹窿 体(Vault)的新型的人工生物粒子及其制造方法。[0

这里介绍的最新人工生物粒子及其制造方法,介绍下面内容:

人工生物粒子及其制造方法

[0001] 本发明涉及使用了能够作为应用于药物释放系统(DDS)等的微囊而使用的穹窿 体(Vault)的新型的人工生物粒子及其制造方法。

[0002] 穹窿体2是粒子尺寸为40nmX40nmX67nm的卵型的巨大的生物粒子,是在细胞内 具有最大的分子量的核酸-蛋白质复合体(参照图2)。存在于生物体内的穹窿体2是由 3 种蛋白质(MVP(MajorVaultProtein,穹窿体主蛋白)、VPARP(vaultpoly(ADP-ribose) polymerase,穹窿体多腺苷二磷酸核糖聚合酶)、TEP1 (telomerase-associated protein-1),端粒酶相关蛋白质-1)和1种RNA构成的。对于穹窿体2,作为主要成分的分 子量约100kDa的MVP3聚集39个而形成碗型的一半穹窿体(各部位被称为帽5、肩部6、主 体7和腰部8),以这2个碗的边缘与边缘吻合的方式在腰部8缔合而形成卵型粒子的外壳。 MVP以外的成分存在于由外壳形成的内部空间。
[0003] 构成穹窿体2的外壳的MVP3由以反向平行0片形成的9个重复结构(3a、3b、 3c、3d、3e、3f、3g、3h、3i)、肩部6、帽螺旋9和帽环10共计12个结构域构成(图3),帽螺 旋9的结构域间的分子间疏水键对于呈碗型的一半的穹窿体的形成是重要的。2个一半的 穹窿体通过使MVP3的N末端之间缔合而形成卵型的穹窿体粒子,该缔合仅由只有离子键 和短的分子间0片这样非常弱的相互作用而形成。这样的穹窿体的结构信息和粒子形成 的机理,由本发明人于2009年成功地阐明来源于大鼠肝脏的穹窿体的整体结构确定(例 如,参照HideakiTanakaetal.,''TheStructureofRatLiverVaultat3. 5Angstrom Resolution"、Science、Vol. 323、pp. 384-388 (2009)(非专利文献 1)。)。
[0004] 一直以来已知的是,穹窿体是在昆虫细胞中使作为其主要成分的MVP表达,从而 形成与生物体内相同的卵型的粒子(例如,参照AndrewG.Stephenetal./'Assemblyof Vault-likeParticlesinInsectCellsExpressingOnlytheMajorVaultProtein''、 TheJournalofBiologicalChemistry、Vol. 276、No. 26、pp. 23217-23220 (2001)(非专利 文献2)。)。穹窿体由于其特征的形态,用作微囊的药物释放系统(DDS)的开发推进(例 如,参照ValerieA.Kickhoeferetal.,"Engineeringofvaultnanocapsuleswith enzymaticandfluorescentproperties"、PNAS、Vol. 102,No. 12、pp. 4348-4352(2005) (非专利文献 3)、ValerieA.Kickhoeferetal.,"TargetingVaultNanoparticles toSpecificCellSurfaceReceptors',、ACSnano、3(l) :27_36.doi:10. 1021/ nn800638x(2009)(非专利文献 4)。)。
[0005] 另外,例如,日本特表2013-509202号公报(专利文献1)中,公开了 :具有MVP以 及融合蛋白质且mINT和重要对象的蛋白质(细胞因子)的重组粒子即穹窿体粒子,用于向 细胞或肿瘤或者对象输送作为重要对象的蛋白质。此外,例如,日本特表2007-508846号公 报(专利文献2)中,公开了如下技术:被多肽包裹的、用于输送多核苷酸的组合物,其具有 亮氨酸拉链作为多核苷酸结合区域。
[0006] 现有的方法中,为了将药剂吸收进粒子内部,作为穹窿体的构成成分且存在于粒 子内部的VPARP的C末端160个残基(INT结构域:与MVP结合)作为标记物而利用。这是 为了使粒子内部保持药剂。然而,该方法中,并没有充分地活用穹窿体的大的内部空间。
[0007] 现有技术文献
[0008] 专利文献
[0009] 专利文献1 :日本特表2013-509202号公报
[0010] 专利文献2 :日本特表2007-508846号公报
[0011] 非专利文献
[0012] 非专利文献 1:HideakiTanakaetal.,"TheStructureofRatLiverVault at3.5AngstromResolution"、Science、Vol. 323、pp.384-388(2009)
[0013] 非专利文献 2:AndrewG.Stephenetal./'AssemblyofVault-likeParticles inInsectCellsExpressingOnlytheMajorVaultProtein''、TheJournalof BiologicalChemistry、Vol. 276、No. 26、pp.23217-23220(2001)
[0014] 非专利文献 3:ValerieA.Kickhoeferetal.,"Engineeringofvault nanocapsuleswithenzymaticandfluorescentproperties''、PNAS、Vol. 102,No. 12、 pp.4348-4352(2005)
[0015] 非专利文献4:ValerieA.Kickhoeferetal./'TargetingVaultNanoparticles toSpecificCellSurfaceReceptors',、ACSnano、3(l) :27_36.doi:10. 1021/ nn800638x(2009)



[0016] 发明要解决的问题
[0017] 本发明是为了解决上述问题而做出的,其目的在于提供使用了能够作为可以应用 于药物释放系统(DDS)等的微囊而使用的、能够有效地利用其大的内部空间的穹窿体的新 型的人工生物粒子及其制造方法。
[0018] 用于解决问题的方案
[0019] 本发明的人工生物粒子的特征在于,在构成穹窿体的腰部的MVP的N末端分别整 合入亮氨酸拉链。
[0020] 本发明的人工生物粒子优选在MVP的N末端与亮氨酸拉链之间存在有连接子。该 情况下,连接子更优选为3~6个甘氨酸。
[0021] 本发明的人工生物粒子中,亮氨酸拉链优选来自酵母的转录活化因子GCN4。
[0022] 本发明还提供人工生物粒子的制造方法,其为制造上述的本发明的人工生物粒子 的方法,所述方法将亮氨酸拉链基因整合至MVP基因的N末端侧,使其表达。
[0023] 本发明的人工生物粒子的制造方法中,将MVP基因与亮氨酸拉链基因不通过限制 性内切酶位点而用编码连接子的基因连接。
[0024]发明的效果
[0025] 通过本发明的人工生物粒子的制造方法,与现有技术相比较,能够格外地以高收 率得到人工生物粒子。本发明的人工生物粒子可以期待作为能够有效地利用其内部空间的 DDS等所能够应用的微囊,通过本发明收量提高了一个数量级,所以与大幅的降低成本相联 系。另外可以期待,将本发明的人工生物粒子作为基础,能够pH依赖地可逆地控制开闭的 粒子的开发推进。

[0026] 图1为示意地表示本发明的人工生物粒子1中的、构成穹窿体2的MVP3的N末端 3a与亮氨酸拉链4的结合的示意图。
[0027] 图2为示意地表示本发明的人工生物粒子1所使用的穹窿体2的图。
[0028] 图3为示意地表示构成穹窿体2的MVP3的图。
[0029] 图4为示意地表示将本发明的人工生物粒子1作为微囊而应用的情况的图。
[0030] 图5为示意地表示将本发明的人工生物粒子1作为微囊而应用的药物释放系统的 一例的图。
[0031] 图6中,图6的左侧为示出破碎后的SDS-PAGE的结果的照片,分别地示出了对于 LZMVP_Gly3的上清(泳道A)、沉淀(泳道B),对于LZMVP_Gly6的上清(泳道C)、沉淀(泳 道D)。另外,图6的右侧为表示蔗糖密度梯度离心分离后的SDS-PAGE的结果的照片,分别 地,左侧的组a表示对于LZMVP_Gly3的结果、右侧的组b表示对于LZMVP_Gly6的结果。
[0032] 图7是对于LZMVP_Gly3显示出最终纯化标准品的电子显微镜照片。

[0033] 图1为示意地表示本发明的人工生物粒子1中的、构成穹窿体2的MVP3的N末端 3a与亮氨酸拉链4的结合的示意图。另外,图2为示意地表示本发明的人工生物粒子1所 使用的穹塵体2的图,图3为不意地表不构成穹塵体2的MVP3的图。如上所述,对于穹塵 体2,作为主要成分的MVP3聚集39个而形成碗型的一半穹窿体(各部位被称为帽5、肩部 6、主体7和腰部8),以这2个碗的边缘与边缘吻合的方式在腰部8缔合而形成卵型粒子的 外壳(图2)。构成穹窿体2的外壳的MVP3是由以反向平行0片形成的9个重复结构(3a、 313、3(:、3(1、36、3厂3§、311、31)、肩部6、帽螺旋9以及帽环10共计12个结构域构成的(图3)。 本发明的人工生物粒子1的特征在于,在构成穹窿体2的腰部8的MVP3的N末端分别整合 入亮氨酸拉链4。
[0034] 本发明的人工生物粒子1优选在MVP3的N末端与亮氨酸拉链4之间存在有连接 子。通过存在有这样的连接子,可以确保在人工生物粒子1中的亮氨酸拉链4的运动的自 由度。
[0035] 本发明的人工生物粒子1中的MVP3的N末端与亮氨酸拉链4之间的连接子优选以 小的氨基酸1~6个直链状地连接而形成。形成连接子的氨基酸的个数为1~6个的任一 者的情况下,具有亮氨酸拉链4的人工生物粒子1也被表达出来,从表达量更多且得到的人 工生物粒子1均匀的观点出发,进而从亮氨酸拉链4的运动的自由度的观点出发,连接子优 选小的氨基酸3~6个直链状地连接而形成。作为构成连接子的氨基酸。例如可列举出: 甘氨酸、丙氨酸等侧链小的氨基酸。后述的本实验例中,示出了由3个或6个直链状的甘氨 酸形成了连接子的例子。
[0036] 亮氨酸拉链4为由约30个残基的氨基酸构成的a-螺旋2根以相互的亮氨酸残 基通过疏水键合而形成的卡盘样的基序。作为本发明中的亮氨酸拉链4,例如,对于来自于 酵母的转录活化因子GCN4的亮氨酸拉链、除此以外的来自于其他的蛋白质的亮氨酸拉链, 也可以没有特别限制地使用。其中,1991年,来自于酵母的转录活化因子GCN4的亮氨酸拉 链的X射线晶体结构在1.8人分辨率下确定,从原子水平知道了由33个残基的氨基酸构成 的肽通过相互的亮氨酸残基疏水键合,形成牢固的卷曲螺旋。因此能够适宜使用来自于酵 母的转录活化因子GCN4的亮氨酸拉链。
[0037] 利用这样的本发明的人工生物粒子,可以期待制成为能够有效地利用其内部空间 的DDS等所能够利用的微囊,通过本发明收量提高了一个数量级,与成本大幅降低相联系。 另外可以期待,将本发明的人工生物粒子作为基础,能够pH依赖地可逆地控制开闭的粒子 的开发推进。
[0038] 此处,图4为示意地表示将本发明的人工生物粒子1作为微囊应用时的图,图5为 示意地表示将本发明的人工生物粒子1作为微囊应用的DDS的一例的图。利用本发明的人 工生物粒子1存在如下可能性,例如:通过对MVP的N末端所带有的亮氨酸拉链导入半胱氨 酸残基,如图4所示,能够开发出在中性条件下利用二硫键形成稳定的卵型粒子、在酸性条 件下通过二硫键的开裂而像正好一分为二地割开鸡蛋那样打开的、pH依赖地能够可逆地控 制开闭的微囊。通过使用这样的微囊也可以考虑如下的DDS:例如,如图5所示,预先在酸性 条件下将药剂11加入至穹窿体2的内部空间,将其投与,从而通过靶细胞13的表面的特异 的抗原12与预先附着于穹窿体2的表面的抗体(Fab)的抗原抗体反应,微囊被吸收至靶细 胞13内,在核内体14内成为酸性条件而微囊打开,药剂11被释放。这样的本发明的人工 生物粒子由于在其内部有非常大的空间,所以可以认为有希望制成为基因治疗时的载体。
[0039] 另外,也可以考虑将本发明的人工生物粒子1制成为封入有化妆品等的成分、渗 透至肌肤的深处的微囊而利用等。
[0040] 另外,近年来,利用蛋白质复合体的内部空间作为铸模,使金属聚合,使聚合产物 规则地排列,从而制作成为极小半导体的基底的基板的技术等也被确立。现在使用铁蛋白 等球状蛋白质,然而还存在利用本发明的人工生物粒子1、使用穹窿体2这样的椭圆的粒 子,从而制成到目前为止没有的新型的基板的可能性。
[0041] 本发明还提供特征在于将亮氨酸拉链基因整合至MVP基因的N末端侧并使其表达 的、人工生物粒子1的制造方法。由此,实验例中如后所述,与使用了由野生型MVP(W-MVP) 形成的W-穹窿体的昆虫细胞的现有的表达系统相比较,能够以10倍以上这样格外高的收 率得到本发明的人工生物粒子1。亮氨酸拉链基因和MVP基因的碱基序列已经公知,通过 适宜组合现有已知的基因工程学手法,能够将亮氨酸拉链基因整合至MVP基因的N末端侧。 后述的实验例中示出了如下的例子:使从酵母的转录活化因子GCN4切出并纯化的亮氨酸 拉链基因的片段、与同样地切出并纯化的来自于大鼠的MVP基因的片段(通过后述的连接 子)连接。
[0042] 对于使在MVP基因的N末端侧整合亮氨酸拉链基因而成的基因表达的细胞,没有 特别的限制,可例示出:昆虫细胞、比昆虫细胞高等的生物的细胞。已知使用比昆虫细胞低 等的例如大肠菌时,存在不能良好地形成生物粒子的情况,优选使用本领域中通常使用的 昆虫细胞而表达。作为昆虫细胞的具体例,可例示出Sf9。所表达的人工生物粒子可以通过 现有已知的合适的方法进行纯化。
[0043] 本发明的人工生物粒子1的制造方法中,优选将MVP基因和亮氨酸拉链基因不通 过限制性内切酶位点而用编码连接子的基因连接。使用上述的来自于酵母的转录活化因子GCN4的亮氨酸拉链基因的片段、来自于大鼠的MVP基因时,如果使其连接,则存在其间残留 有EcoRI的位点(GAATTC),阻碍穹窿体粒子的形成的可能性。在后述的实验例中,将EcoRI 位点置换为连接有3个残基或6个残基的为具有最小侧链的氨基酸的甘氨酸的Gly连接 子,之后在昆虫细胞中使之表达。具体而言,根据想要导入的连接子设计引物,PCR之后,使 纯化的片段夹在MVP基因的N末端与亮氨酸拉链基因之间地连接即可。
[0044] 需要说明的是,本发明的人工生物粒子1的制造方法中,亮氨酸拉链、连接子等优 选的是也如人工生物粒子1所述。
[0045] 以下,列举出实验例对本发明详细地进行说明,但是本发明不限定于此。
[0046] <实验例>
[0047] 〔1〕利用昆虫细胞Sf9的野生型MVP(W-MVP)的大量表达系统的构筑
[0048] 〔A〕克隆了W-MVP的重组杆状病毒(BacmidDNA)的调制
[0049] 按照以下的步骤进行作业。
[0050] (1)将来自大鼠肝脏的MVP(W-MVP)的DNA用EcoRI和SphI的限制性内切酶位点 导入至pFastBac载体。
[0051] (2)将得到的pFastBac在大肠菌(DH5a)中进行转化,接种至加入了氨节西林 (100yg/mL)的LB平板,在37°C下静置培养24小时。
[0052] (3)用接种环等挑取多个菌落,利用菌落PCR确认靶基因是否扩增。
[0053] (4)将上述(3)中能够确认到基因扩增的菌落接种至加入了氨苄西林(100yg/ mL)的LB液体培养基5mL中,37°C下振荡培养一晚。
[0054] (5)从培养了 一晚的大肠菌(DH5a)中,使用QIAGEN公司的QIApr印Spin MiniprepKit,对克隆了W-MVP的pFastBac进行纯化。
[0055] (6)将克隆了W-MVP的pFastBac0? 1yg加入至DHlOBac20yL,轻轻地混合之 后,在冰上静置20分钟。
[0056] (7)在42°C下进行1分钟热休克,在冰上静置2分钟之后,加入200yL的S0C培 养基,37°C下振荡培养4小时。
[0057](8)将上述(7)的培养液向加入了卡那霉素(50yg/mL)、庆大霉素(7yg/mL)、四 环素(10Ug/mL)、X-gal(100yg/mL)、IPTG(50yg/mL)的LB平板中接种 20yL,37°C下静 置培养24小时(培养至能够辨别有无菌落的显色(蓝色或白色)为止)。
[0058] (9)用接种环等挑取白色的菌落,接种至新的LB平板(与上述相同),37°C下静置 培养一晚之后,再次确认有无显色。
[0059] (10)将上述(9)中再确认的来自于白色的菌落的大肠菌(DH5a)接种至加入了 卡那霉素(50yg/mL)、庆大霉素(7yg/mL)、四环素(10yg/mL)的LB液体培养基5mL中, 37°C下振荡培养一晚。
[0060] (11)从培养了 一晚的大肠菌(DHlOBac)中,使用QIAGEN公司的QIApr印Spin MiniprepKit,对克隆了W-MVP的Bacmid进行纯化。Bacmid的尺寸非常大,所以进行纯化 时,洗脱缓冲液使用加温至70°C的缓冲液。
[0061] 〔B〕克隆了W-MVP的重组杆状病毒的增殖(病毒液的制作)
[0062] 在安全柜内,按照以下的步骤进行。
[0063] (1)将用Invitrogen公司的Sf900-II培养基(加入了 10%血清)培养中的Sf9 细胞(1.5-2.0\106细胞/1^)在1511^管内使用5€900-11培养基(加入了10%血清)进 行稀释,由此将浓度调制为1. 2X105细胞/mL。
[0064] (2)向12孔培养平板中加入调制成终浓度0.4X105细胞/mL的细胞培养液 lmL。加入上述的1.2X105细胞/mL的培养液300yL、Sf900-II培养基(加入了 10%血 清)700yL,总计设为lmL。
[0065] (3)在27°C下静置20分钟,使细胞粘附于细胞培养平板的底面。
[0066] (4)在 1. 5mL管内将Gracemediumunsupplement214yL、Cellfectin8yL、 Bacmid1yg混合,在安全柜内室温下放置30分钟(Cellfectin用祸流搅拌器搅拌10秒左 右后使用)。
[0067] (5)对于上述(3)中的12孔培养平板进行倒立显微镜观察,确认到细胞附着于容 器的底面,然后取出培养基(边将平板向里面倾斜边将盖以立在面前的方式放置,用移液 枪吸出)。
[0068] (6)取出培养基之后,用GracemediumunsupplementlmL进行清洗。扔掉清洗 液。
[0069] (7)之后,对细胞加入上述的Bacmid与Cellfectin的混合液。
[0070] (8)将12孔平板加入至密闭的Tupperware内,27°C下静置4小时。为了保持 Tupperware内的湿度,将用纯水润湿的多枚Kimwipe和含有lmL的0. 5MEDTA的物质置于 Tupperware的端部。
[0071] (9) 4 小时后,将Gracemediumunsupplement(加入了 10 %血清)400yL铺开, 27°C下进行培养2天。
[0072] (10)经过2天培养后,将培养液用1. 5mL的管转移,通过高速离心分离(4000Xg、 3分钟)下使细胞沉淀。由于上清是病毒液(P0),所以将其转移至新的1.5mL的管中。病 毒液(P0)在贴有遮光膜的4°C的培养箱(chromatographychamber)内保存。
[0073] (11)向底面积25cm2的培养烧瓶中以细胞数成为3X10 6细胞的方式加入培养液 (总计设为5mL)。例如,用Sf900-II培养基(加入了 10%血清)培养中的Sf9细胞的细胞 数为IX106细胞/mL时,将向培养液3mL中加入Sf900-II培养基(加入了 10%血清)2mL 而成5mL的物质加入至培养烧瓶。
[0074] (12)在27°C下静置15分钟,使细胞粘附于细胞培养烧瓶的底面。
[0075] (13)加入P0的病毒液200yL,培养3天。
[0076] (14)经过3天培养后,在回收病毒液(P1)之前,向底面积75cm2的培养烧瓶中以 细胞数成为9X106细胞的方式加入培养液(总计成为15mL)。准备15mL的6X10 5细胞/ mL的培养液,总计的细胞数成为9X106细胞。
[0077] (15)在27°C下静置15分钟,使细胞粘附于细胞培养烧瓶的底面。
[0078] (16)在回收病毒液(P1)之前,从上述的底面积25cm2的培养烧瓶中,使用移液管 取出0.5mL的上清液,加入至上述(14)的培养液中(用于防止污染物)。之后,将培养液在 27°C下培养3天。
[0079] (17)将残留的培养液边用移液管吸取或排出,同时将附着于烧瓶底面的细胞剥 离,转移至15mL的管中,通过高速离心分离(4000Xg、3分钟)使细胞沉淀。由于上清成为 病毒液(PI),所以将其转移至新的15mL的管中。作为沉淀落下的Sf9细胞在-80°C下冷冻 保存,用于表达检测。病毒液(P1)在贴有遮光膜的4°C的培养箱内保存。
[0080] (18)用底面积75cm2的培养烧瓶培养3天后,边用移液管吸取或排出培养液边将 附着于烧瓶底面的细胞剥离,转移至50mL的管中,以高速离心分离(4000Xg、3分钟)使细 胞沉淀。由于上清成为病毒液(P2),所以将其转移至新的50mL的管中。作为沉淀落下的 Sf9细胞在-80°C下冷冻保存,用于表达检测。病毒液(P2)在贴有遮光膜的4°C的培养箱内 保存。
[0081] (19)在1L的旋转烧瓶中准备1X106细胞/mL的培养液300mL,加入病毒液 (P2)3mL(培养基的1%量),在27°C下培养3天。
[0082] (20)经过3天培养后,将培养液转移至离心管,通过高速离心分离(4000Xg、30分 钟)使细胞沉淀。由于上清为病毒液(P3),所以将其转移至新的500mL的培养基瓶中。此 时使用的离心管、离心管的盖、培养基瓶预先用铝箔包裹,用高压釜进行灭菌。作为沉淀落 下的Sf9细胞在-80°C下冷冻保存,用于纯化。病毒液(P3)在贴有遮光膜的4°C的培养箱 内保存。
[0083] (21)在3L的旋转烧瓶中准备1X106细胞/mL的培养液500mL,加入病毒液 (P3)5mL(培养基的1%量),在27°C下培养3天。
[0084] (22)经过3天培养后,将培养液转移至离心管,通过高速离心分离(4000Xg、30分 钟)使细胞沉淀。由于上清为病毒液(P4),所以将其转移至新的500mL的培养基瓶中。此 时使用的离心管、离心管的盖、培养基瓶预先用铝箔包裹,用高压釜进行灭菌。作为沉淀落 下的Sf9细胞在-80°C下冷冻保存,用于纯化。病毒液(P4)在贴有遮光膜的4°C的培养箱 内保存。
[0085] 〔2〕昆虫细胞Sf9的N末端附着有亮氨酸拉链的MVP(LZ-MVP)的大量表达系统的 构筑
[0086] 按照以下的顺序进行作业。
[0087] (1)将编码来自于酵母菌的GCN4(281氨基酸)的氨基酸序列(序列号1)第249 位的精氨酸至第281位的精氨酸为止的DNA(亮氨酸拉链基因)(包含BamHI和EcoRI的限 制性内切酶位点)(序列号2)(将表达的亮氨酸拉链的氨基酸序列示于序列号3)导入至 PromegaKK?的pGEM-T载体,使用QIAGEN公司的QIAprepSpinMiniprepKit,对克隆有 亮氨酸拉链的质粒进行纯化。将导入至pFastBac的亮氨酸拉链基因的碱基序列(包含限 制性内切酶位点(BamHI、EcoRI)、起始Met)示于序列号4,将被表达的亮氨酸拉链的氨基酸 序列示于序列号5。
[0088] (2)使用限制性内切酶BamHI和EcoRI从pGEM-T载体中切出亮氨酸拉链基因。
[0089] (3)同样地,对克隆了来自于大鼠的W-MVP的pFastBac也预先使用限制性内切酶 BamHI和EcoRI进行处理。
[0090] (4)对于上述⑵和(3)中得到的亮氨酸拉链基因的片段和MVP基因的片段分别 进行琼脂糖凝胶电泳,切出目标条带,使用Quiagen公司的QIAquickGelExtractionKit, 从凝胶中纯化出目标物。
[0091](5)使用TAKARABIOINC?的DNALigationKit(MightyMix),使上述(4)中纯 化的两者连接(将连接后的碱基序列示于序列号6,将被表达的亮氨酸拉链、MVP的氨基酸 序列示于序列号7、8)。
[0092] (6)以下,进行与上述的克隆了W-MVP的重组杆状病毒的调制(步骤(1)-(11))、 以及克隆了W-MVP的重组杆状病毒的增殖(步骤(1)-(20))相同的操作,使克隆了LZ-MVP 的重组杆状病毒增殖,制作成病毒液(P4)。
[0093] 〔 3〕向LZ-MVP的亮氨酸拉链与MVP之间插入甘氨酸连接子
[0094] 上述构筑的表达系统中,在亮氨酸拉链基因与MVP基因之间残留有EcoRI的位点 (GAATTC),有阻碍穹窿体粒子的形成的可能性,所以本发明人将其置换为连接有具有最小 侧链的氨基酸(甘氨酸(Gly)) 3个残基(Gly3)(将氨基酸序列示于序列号9)或6个残基 (Gly6)(将氨基酸序列示于序列号10)的Gly连接子。
[0095] (1)制成以下的3种引物(编码Gly的碱基序列为gcc)。
[0096] ?正向引物(forwardprimer) (lzmvp_0g_f)
[0097]atggcaactgaagaggccat(序列号 11)
[0098] ?正向引物(lzmvp_3g_f)
[0099]ggcggcggcatggcaactgaagaggccatcatccgcatc( #歹12)
[0100] ?反向引物(lzmvp_3g_r)
[0101] GCCAGATTAAAGAAATTAGTTGGCGAACGCggcggcggc(序列号 13)
[0102] 需要说明的是,反向引物(reverseprimer)的互补序列如下。
[0103]gccgccgccgcgttcgccaactaatttctttaatctggc(序列号 14)
[0104] (2)插入Gly3残基的连接子时,插入lzmvp_0g_f和lzmvp_3g_r、Gly6残基的连 接子时,使用lzmvp_3g_f和lzmvp_3g_r作为引物,将先制成的LZ-MVP的pFastBac作为模 板,使用T0Y0B0C0.,LTD?制的KOD-plusMutagenesiskit,进行PCR(94°C、2分钟一98°C、 10秒一68°C、8分钟(将下划线部分设为10循环))。
[0105] (3)PCR之后,使用T0Y0B0CO.,LTD?制的KOD-plusMutagenesiskit所包含的 Dpnl对模板质粒进行消化。在1. 5mL管内将PCR产物50yL和Dpnl2yL进行混合,轻敲、 停转之后,在37°C下孵育1小时。
[0106] (4)在1. 5mL管内将上述(3)的反应液2yL、灭菌水7yL、Ligationhigh5yL和 T4多核苷酸激酶1yL按照这样记载的顺序加入,轻敲、停转之后在16°C下孵育1小时。
[0107] (5)向大肠菌DH5a50yL中加入上述(4)的反应液5yL,在冰上静置30分钟。
[0108](6)42°C下进行45秒热休克。
[0109](7)在冰上静置2分钟。
[0110] (8)加入S0C培养基450yL,在37°C下振荡培养1小时。
[0111] (9)将上述⑶的培养液50yL接种至加入了氨苄西林(100yg/mL)的LB平板。
[0112] (10)37°C下静置培养一晚。
[0113] 之后,进行与上述的克隆了W-MVP的重组杆状病毒的调制步骤(2)-(20)同样的操 作,制成在亮氨酸拉链与MVP之间导入了Gly连接子的LZMVP(LZMVP_Gly3、LZMVP_Gly6)的 病毒液(P4)。
[0114] 〔4〕穹窿体(W-穹窿体、LZ-穹窿体)的纯化
[0115] (1)用3L的旋转烧瓶培养500mL的Sf9细胞,在细胞数成为1X106细胞/mL时, 加入P4或P3的病毒液进行感染,培养3天。
[0116] (2)经过3天培养后,将培养液转移至离心管,通过高速离心分离(4000Xg、30分 钟)使细胞沉淀。
[0117] (3)将沉淀的细胞使用PBSBuffer进行悬浮,将悬浮液转移至离心管,进行高速 离心分离(4000Xg、30分钟),从而清洗细胞,去除培养基成分等。
[0118] (4)将以沉淀的形式而得到的细胞用细胞破碎使用BufferA(50mM Tris-HCl(pH7.5)、75mMNaCl、1.5mMMgCl2、lmMDIT、lmMPMSF、蛋白酶抑制剂?动物细胞 用(Nacalaitesque制)2 根)100mL悬浮,进行超声波破碎(TOMYUD-201、0UTPUT2、DUTY 60、2 分钟X2)。
[0119](5)将破碎液使用高速离心机(BeckmanHP-26XP、JA25. 50rotor),以 14300rpm、 30分钟、4°C进行高速离心分离,由此将细胞破碎片以沉淀的形式而取出。
[0120] (6)将上清使用超高速离心机(HitachiCP80WX、P45ATrotor),以 40000rpm、2 小 时、4°C进行超高速离心分离,由此使穹窿体级分以沉淀的形式而落下。
[0121 ] (7)向作为沉淀而得到的穹窿体级分中加入少量纯化用BufferA(50mM Tris-HCl(pH7.5)、75mMNaCl、1.5mMMgCl2、lmMDIT、lmMPMSF),用杜恩斯匀浆器(Dounce homogenizer)进行悬浮。
[0122] (8)向上述(7)的溶液中加入等量的聚蔗糖/蔗糖缓冲液(Ficoll/Sucrose BufTer)(9〇mMMES-NaOH(pH6.5)、10mM磷酸钠(Sodiumphosphate)、lmMMgCl2、0.5mM EGTA、0. 02%NaN3、14%Ficoll-PM70、14%Sucrose),良好地进行混合。
[0123] (9)将上述(8)的溶液使用超高速离心机(HitachiCP80WX、P45ATrotor),以 25200rpm、10分钟、4°C进行超高速离心分离,将不要的物质以沉淀的形式而落下。
[0124] (10)将上清的穹窿体级分使用纯化用BufferA进行4倍稀释,使用超高速离心机 (HitachiCP80WX、P45ATrotor),以40000rpm、2小时、4°C进行超高速离心分离,将穹窿体 级分以沉淀的形式而落下。
[0125] (11)向以沉淀的形式而得到的穹窿体级分中加入少量纯化用BufferA,用杜恩斯 匀浆器进行悬浮。
[0126] (12)用超高速离心机(HitachiCP80WX、P28Srotor)的离心管制作蔗糖的密度梯 度。由离心管的底部分别重叠 60%、50%、45%、40%、30%、20%鹿糖(311(:1'〇86)4111]^、51111、 5mL、5mL、5mL、5mL。将其制成 4 管。
[0127] (13)将上述(11)的溶液5mL与上述(12)的蔗糖密度梯度的20%层上重叠。
[0128](14)使用超高速离心机(HitachiCP80WX、P28Srotor),以 25000rpm、16 小时、 4°C进行超高速离心分离。
[0129] (15)穹窿体包含于40-45%级分和50%级分的一部分中,用移液管将其回收。回 收全部40、45%级分(各5mL),回收一半50%级分(2. 5mL)。
[0130] (16)将上述(15)的回收液用纯化用BufferA进行4倍稀释,使用超高速离心机 (HitachiCP80WX、P45ATrotor),以40000rpm、2小时、4°C进行超高速离心分离,由此使穹 窿体级分以沉淀的形式而落下。
[0131] (17)向以沉淀的形式而得到的穹窿体级分中加入少量BufferA,用杜恩斯匀浆器 进行悬浮。
[0132] (18)使上述(17)的穹窿体试样通过0.22ym的滤器,取出碎片等。
[0133] (19)在流通了凝胶过滤用BufferA(50mMTris-HCl(pH7. 5)、75mMNaCl、l. 5mM MgCl2、lmMDTT) 2柱床体积而平衡化的凝胶过滤柱(GEHealthcareJapan制,Sephacryl S-500、26/60)上加载上述(18)的试样2mL,以流速0. 5mL/分钟分取各4mL。
[0134] (20)目标穹窿体级分在加载试样后140~190mL(分馏物No. 39-49)时出来,对 其进行回收,使用超高速离心机(HitachiCP80WX、P45ATrotor),以40000rpm、2小时、 4°C进行超高速离心分离,由此使穹窿体级分以沉淀的形式而落下。(90~110mL(分馏物 No. 27-30)时,穹窿体的聚集体出来,所以将其取出而能够得到均一的穹窿体粒子)。
[0135] (21)向以沉淀的形式而得到的穹窿体级分中加入少量BufferA,用杜恩斯匀浆器 进行悬浮,将其作为最终纯化标准品。
[0136] 此处,图6的左侧为表示破碎(上述步骤(9))后的SDS-PAGE的结果的照片,分别 地示出了对于LZMVP_Gly3的上清(泳道A)、沉淀(泳道B),对于LZMVP_Gly6的上清(泳 道C)、沉淀(泳道D)。另外,图6的右侧为表示蔗糖密度梯度离心分离(上述步骤(14)) 后的SDS-PAGE的结果的照片,分别地左侧的组a表示对于LZMVP_Gly3的结果,右侧的组b 表示对于LZMVP_Gly6的结果。另外,图7为表示对于LZMVP_Gly3的最终纯化标准品的电 子显微镜照片。
[0137] 〔5〕纯化的穹窿体的蛋白质定量
[0138] (1)使用PiasCorporation的BCA蛋白分析试剂盒(BCAProteinAssayReagent Kit),对于如上述而得到的W-MVP、LZMVP_Gly3和LZMVP_Gly6,进行蛋白质定量。
[0139] (2)将试剂盒的试剂A5mL、试剂B100yL加入至15mL管中,良好地进行混合。
[0140] (3)准备加入了上述(2)的混合溶液500yL的1. 5mL的微量离心管(Eppendorf tube) 7 管。
[0141] (4)将事先准备的5个BSA标准溶液(1000、500、250、125、62. 5yg/ml)分别取 25yL,加入至上述(3)的1. 5mL管中,用涡流充分混合。
[0142] (5)将定量的穹窿体溶液(包含W-MVP、LZMVP_Gly3或LZMVP_Gly6)用超纯水稀 释而成的溶液制成2种(例如:5倍稀释和10倍稀释、25倍稀释和50倍稀释等)。
[0143] (6)将上述(5)中制作的穹窿体的稀释溶液2种分别加入至上述(3)的1. 5mL管 中,用涡流充分混合。
[0144] (7)将上述⑷和上述(6)的1. 5mL管在37°C下进行30分钟孵育。
[0145] (8)使用分光光度计,测定上述(7)的562nm下的吸光度(利用双缩脲反应的还原 Cu(+)与二喹啉甲酸(BCA)的配位进行比色定量)。
[0146] (9)首先,对于BCA,将测定结果用纵轴表示吸光度、横轴表示BSA浓度进行作图, 用最小二乘法求出近似曲线(标准曲线)。
[0147] (10)由上述(9)的标准曲线求出穹窿体的稀释溶液的浓度,由稀释倍率求出穹窿 体原液的浓度。
[0148] (11)使穹窿体原液的浓度乘以总液量,计算穹窿体的总收量。
[0149] (12)结果,每1L培养基W-穹窿体(比较例1)为3~5mg,与此相对,LZ-穹窿体 (LZMVP_Gly3(实施例1)、LZMVP_Gly6(实施例2))中得到超过约10倍的70~80mg的收 量。
[0150] 应该认为,本次公开的实施方式和实验例均以点例示,并没有限制。本发明的保护 范围不仅包括上述的说明,还包括权利要求书所示的、在与权利要求书等同的含义和范围 内所有的变更。
[0151]附图标iP,说明
[0152] 1人工生物粒子、2穹窿体、3MVP、4亮氨酸拉链、5帽、6肩部、7主体、8腰部、9帽螺 旋、10帽环、11药剂、12抗原、13靶细胞、14核内体。

1. 一种人工生物粒子(I),其特征在于,在构成穹窿体(2)的腰部(8)的MVP(3)的N 末端分别整合入亮氨酸拉链(4)。
2. 根据权利要求1所述的人工生物粒子(1),其中,在MVP(3)的N末端与亮氨酸拉链 (4)之间存在有连接子。
3. 根据权利要求2所述的人工生物粒子(1),其中,所述连接子为3~6个甘氨酸。
4. 根据权利要求1所述的人工生物粒子(1),其中,亮氨酸拉链来源于酵母的转录活化 因子GCM。
5. -种制造权利要求1~4的任一项所述的人工生物粒子(1)的方法, 所述方法将亮氨酸拉链基因整合至MVP基因的N末端侧,使亮氨酸拉链基因表达。
6. 根据权利要求5所述的人工生物粒子(1)的制造方法,其特征在于,将MVP基因与亮 氨酸拉链基因不通过限制性内切酶位点而用编码连接子的基因连接。
提供一种人工生物粒子(1),其特征在于,在构成穹窿体(2)的腰部(8)的MVP(3)的N末端分别整合入亮氨酸拉链(4),以及通过将亮氨酸拉链基因整合至MVP基因的N末端侧,使之表达的人工生物粒子(1)的制造方法,使用了能够作为可以应用于药物释放系统(DDS)等的微囊而使用的、能够有效地利用其大的内部空间的穹窿体的新型的人工生物粒子及其制造方法。
C07K14-47, C12N15-09, C07K19-00
CN104797709
CN201380060146
田中秀明
国立研究开发法人科学技术振兴机构
2015年7月22日
2013年11月8日
EP2921555A1, WO2014077195A1

最新人工生物粒子及其制造方法的相关内容如下:

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